分子生物学技术在环境微生物检测和污染治理中的应用

摘要综述了聚合酶链式反应技术（PCR）、生物芯片技术、酶联免疫吸附技术（ELISA）、生物传感器4 种现代分子生物学技术的基本原理及其在环境微生物检测和治理中的应用，以期为现代分子生物学技术在环境微生物检测和治理中的进一步研究提供参考。

关键词环境微生物；聚合酶链反应；生物芯片；酶联免疫吸附技术；生物传感器

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2016）02-171-03

AbstractThe basic principles of 4 kinds of modern molecular biology techniques including polymerase chain reaction（PCR），biochip technology，enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA），biosensors were reviewed，as well as their application in environmental microbe monitoring and management. The aim was to provide reference for further research of modern molecular biology technique in environmental microbe monitoring and management.

Key wordsEnvironmental microbes； Polymerase chain reaction； Enzyme labeled immunosorbent assay； Biosensor

随着分子生物学技术的不断发展，新的微生物检验技术和方法被广泛研究和应用。近年来经过国内外学者不断努力，已建立了多种快速、简便、特异和低耗的微生物检验技术和方法。分子生物学技术为研究微生物种群多样性、菌种鉴定和分析提供了全新的技术手段，大大提高了对复杂微生物体系的认识和分析能力。微生物是生态系统中的分解者， 有助于水体自净和水体修复。微生物可去除有机污染物和无机污染物，为保护和修复环境创造了条件。微生物在环境监测和治理中存在两面性，水环境与微生物之间相互依存又互相影响。笔者综述了近年来应用于各种环境微生物检测和治理中的分子生物学技术及其应用，以期为相关的研究提供参考。

1几种分子生物学技术及其在环境微生物检测中的应用

1.1聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是美国科学家 Mullis等[1]发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，又称基因的体外扩增。此反应以4种脱氧核苷酸为底物，在耐高温聚合酶的作用下，对DNA序列进行扩增。PCR技术的基本原理与DNA的天然复制过程相似，其特异性由寡核苷酸引物决定。PCR由变性、退火、延伸3个基本步骤构成：①变性。模板DNA经加热至93 ℃左右后或在碱性条件下，DNA双链的氢键断裂，双链DNA解离成为单链，称之为DNA变性，以便与引物特异性结合； ②退火。温度降至55 ℃左右后，解离后的单链DNA与引物特异性结合，形成局部双链，引物一般根据目标DNA序列人工合成； ③延伸。在Taq酶的最适温度（72 ℃）下，以引物3′端为合成起点，以单核苷酸为原料，在 72 ℃下，Taq DNA 聚合酶从引物的 3′端起始，dNTP为底物，靶序列为模板，以5′→3′方向延伸，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成DNA新链。重复循环变性、退火、延伸过程即可获得更多的新链，这种新链又紧接着成为下次循环的模板。由此看来，PCR 反应速度极快，待扩增基因呈2n倍扩增，几个小时内单拷贝的基因经30个左右循环即可扩增百万倍[2]。PCR 技术中， 设计引物的质量至关重要。在使用 Primer Premier 5.0 等软件进行引物设计时， 要对引物的5′端和3′端进行修饰。为提高扩增产物的量，可以将产物DNA稀释100倍左右作为第二轮模板进行扩增，一般二次扩增后的DNA数量能满足所有分子生物学操作的要求。与传统的微生物检测方法相比，PCR 具有特异性强、灵敏度高、操作快捷、迅速省时等优点。

目前，PCR技术在微生物检测中运用最广泛的是对样本中病原微生物的核酸进行检测。通过在反应试管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行扩增，可鉴定出一种以上的病原体。此技术不受混合标本多少和微生物生长时间长短的限制，即便存在大量死菌也能得到准确结果，如对乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒和禽流感病毒的检测等。PCR技术可改变微生物检测的方式和方法，促进分子生物学和环境微生物学、医学的相互发展，使微生物检测可在分子水平上确诊，而不再局限于外部特征、形态结构和生理特性等。

1.2生物芯片技术生物芯片技术是20世纪90年代以来影响深远的科技进展之一，是融合微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学等学科为一体的高度交叉的尖端新技术[3]。按照芯片上固化的生物材料不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、多糖芯片等；根据反应体系状态的不同，可分为固相芯片和液相芯片。液相芯片较传统的固相芯片相比，检测结果更准确，信息质量更稳定，检测用时更少以及操作更简便。因此，液相芯片更广泛地应用于生命科学研究的各个领域，特别在病原菌感染的检测方面，具有广阔的应用前景。法国某企业开发了一种生物芯片，可随时检测饮用水中微生物的变化[4]。目前，液相芯片技术在基因检测、细胞检测、蛋白质分析和药物检测等方面运用广泛，是临床检测和科学研究的推动力[5]。

1.2.1基因芯片技术。

随着“人类基因组计划”的完成，基因芯片技术已发展成为生物芯片技术一个最完备的分支，迅速成为国内外研究的热点。其原理是根据核酸的分子杂交衍生而来，用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测[6]，通过杂交信号进一步分析目的序列。基因芯片又称 DNA 微 阵 列（DNA microarray），可以分为两类 ：一是 cDNA 芯片，用于表达谱的研究，二是寡核苷酸芯片，用于表达谱的研究和基因组学的相关研究。基因芯片技术的兴起给微生物检测带来了新的技术革命，近年来已有此技术应用于大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌检测的报道[7]。基因芯片技术还可用于检测多部位基因序列和基因变异，具有检测突变点多、准确性高、快速等优点。基因芯片技术广泛应用于病毒病的流行病学调查，可达到对传染病的流行进行预测和防控的目的。在环境微生物学中，基因芯片技术可用于检测环境微生物群落的组成结构、生理状态、功能活动和系统发育等。

1.2.2蛋白芯片技术。

蛋白芯片技术作为生命科学研究的新技术平台，可以弥补基因芯片技术的不足，能在翻译水平上对蛋白、 抗体等进行检测。蛋白芯片技术的原理是利用抗原抗体的特异性结合，而基因芯片技术的原理是通过碱基的特异性互补配对。蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，通过对固相载体进行特殊化处理，将已知的蛋白产物固定在酶、抗原、受体等载体上，根据这些生物分子的特性，即可捕获与之特异性结合的待测蛋白，后经洗涤、纯化，再利用荧光扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，进行确认和生化分析，可判断生物体中是否含有该蛋白对应的转基因成分，进一步还可测定该蛋白质功能。蛋白芯片技术的快速发展，有力地促进了蛋白诊断和蛋白质组学等相关研究。蛋白芯片技术可应用于艾滋病病毒的检测和鉴定、乙型肝炎表面抗原的鉴定和血清中多种抗体的同时检测等。

生物芯片技术与传统微生物检测方法相比，样品需求量少，检测效率高，快速直接，可方便快捷地帮助医学工作者揭示疾病发生的分子机制，从而寻找更为合理有效的治疗方法和途径，在微生物检测领域具有广阔的发展前景。

1.3酶联免疫吸附测定技术（ELISA）

ELISA是将酶的催化作用与抗原抗体特异性技术手段相结合而建立的一种超微量的测定技术。ELISA法是在荧光免疫和放射免疫分析的基础上发展起来的，酶标记抗原或抗体后，不会影响抗原抗体的活性和酶自身的活性。对受检样品中的酶标免疫反应的试验结果，用光学分析仪器进行光度测定。此技术特异性强，灵敏度高，检测用时短，成本价格低，判断结果精确等，已被广泛应用于食品安全检测和污染物中农药残留量的检测。有些发达国家如美国、德国已开发出试剂盒应用于食品、蔬菜和环境中农药残留的检测分析[8]。

1.4生物传感器生物传感器集微电子学、材料科学和生物技术等多种学科，是一种对生物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。生物传感器是一个独立的、完整的装置，通过利用与换能器保持直接空间接触的生物识别元件，提供特殊的定量与半定量分析信息。生物传感器由生物识别元件和换能器两部分组成。采用常用识别原件如酶、抗体、核酸、细胞受体等识别待测物的浓度等，然后转译为一定灵敏度的生物活性信号，再由换能器将生物活性信号转换为电信号。常用的换能器有电化学器件、光电管、声波器件、压电器件和热敏电阻器等。生物传感器应用十分广泛，可用于水环境和大气环境的检测、微生物细胞数目的测定，其在发酵工业、环境监测、医学领域等也早有应用。白志辉等[9]利用硫化物杆菌制成硫化物传感器，应用于生活污水、工业废水等样品中的硫化物测定。

微生物传感器是将微生物细胞与换能器结合在一起，所固定的微生物可以是有活力的细胞，可利用其呼吸代谢作用；也可以是无活力的微生物细胞，常被用作酶的廉价替代品。微生物传感器具有3个优点：①稳定性好，使用寿命长；②专一性强，只对特定的底物起反应，且不受颜色、浊度的影响；③可克服酶提取困难、价格昂贵和不稳定的缺点[10]。

2分子生物学技术在环境微生物治理中的应用

现代分子生物学技术可从微观角度分析污染物的组成成分，从而降解污染物，有助于治理环境污染，既快速又高效。利用分子生物学技术筛选有价值的功能性微生物并加以培养和利用，对污水处理效果明显。利用微生物处理环境污染物具有快速、低耗、成本低、反应条件温和以及无二次污染等优点。因此，科学家运用基因工程技术构建高效菌种来治理环境中难以降解的复杂毒害化合物，如人工合成塑料、除草剂等。超级细菌在石油烃污染的环境修复中起到了重要作用：将微生物分解纤维素和木质素的基因转入中温细菌中，使发酵在较高温度下也能进行，还可用于发酵废弃物产生天然气[11]。随着人们对环境保护意识的加强和分子生物学技术研究的不断进步[12]，环境污染治理的相关研究已渗透到各个科学技术领域。近年来，消除重金属污染一直是世界性难题，人类运用植物提取修复技术消除重金属污染物已取得显著成果[13]。其原理是将环境中残存的重金属污染物吸收、富集到植物体内，然后将植物经过焚烧等途径回收重金属，以此减少重金属对环境的污染。植物提取修复技术操作简单，效益高，具有很大的经济价值[14]。

3结语

随着现代分子生物学技术的迅速发展，运用各种生物学技术鉴定污水中微生物种群和基因型，更进一步掌握污水生物处理系统中微生物群体的多样性和功能特点，从而达到环境污染治理的目的。随着分子生物学技术的日趋成熟，分子生物学技术越来越多地被应用于污染治理研究中，因其高度的特异性、灵敏性在环境微生物污染治理中的应用必将更为广泛。从分子水平上阐述污水生物处理的机制，对微生物环境治理具有深刻的理论意义与应用价值。新技术的日益成熟必将对环境微生物的研究有一个整体的、系统的认识，也必将使研究更具目标性和可控性。

参考文献

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