HIV病毒分子生物学检测技术最新进展

【摘 要】随着艾滋病感染患者的增多，为适应艾滋病大规模筛查和尽量早期诊断治疗的需要，目前艾滋病检测技术向着简易、快速、可靠的方法的方向发展，HIV核酸检测的灵敏度和特异性显著提高，缩短检出HIV的窗口期，在艾滋病早期诊断和治疗以及艾滋病的预防方面发挥着重要作用，是HIV实验室诊断发展的主要方向。本文对HIV核酸检测的各种技术原理、特异性、可靠性及临床实用性的前沿研究进展进行综述。

【关键词】HIV病毒；分子生物学检测；进展

艾滋病病毒（HIV）主要侵袭人体免疫系统，导致人体免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。艾滋病的不可治愈及其快速传播使患者不断增多，2012年全球感染总人数已达3900万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发现，为了防止艾滋病的大规模流行，艾滋病的检测工作越发重要。目前筛查的免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的传播蔓延有重要意义。

1 HIV生物学特性

HIV呈圆形或椭圆形，直径900～140nm，外层为类脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构——基因长末端重复序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，还有非常复杂的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV基因组中存在3个gag-pol- env.Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的外围，由主要的P24和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gp120和gp41，起协助HIV进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关[1]。

根据env基因V3段碱基排列的不同，HIV-1分为11个亚型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亚型，HIV-2分为6个亚型[2]，不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上有着重要意义。

2 HIV-1的感染机制及感染标志

病毒侵入人体后，通过病毒表面gpl20在化学因子CCR5或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41的协助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下复制DNA，此DNA部分存留在胞浆内产生系列变化，然后在细胞膜上装配成新病毒，再感染其它细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗体[3]。

3 分子生物学检测技术

随着分子生物学检测技术快速发展，HIV RNA或DNA检测得到应用，核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方向[4]，在HIV感染的监测、诊断、研究、疗效观察及预后判断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两类。

3.2 定性检测

3.2.1 原位杂交（insite hydzmion）

应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合酶链反应（PCR）略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛使用，基因探针技术也就逐渐失去应用意义。

3.2.2 聚合酶链反应技术（PCR）

PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。患者感染HIV 1～14d后血浆中能检测出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的診断中有着非常重要的意义，前病毒DNA PCR检测法对出生48h内的婴儿检测敏感性为38%，出生14d的婴儿检测敏感性达93%[5]。

3.2.3 逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）

RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现，即将病毒RNA逆转录DNA，接着进行PCR，指数扩增DNA片段，将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR技术可在2h内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，准确定量的RT-PCR方法已被许多商业实验室证实，目前多种改良的快速RT-PCR检测方法应用于HIV的快速临床诊断[6，7]。

PCR灵敏度高、特异性强、操作简便，但易污染出现假阳性结果；此外，HIV基因的多样性，尚无一套引物能够覆盖所有的HIV序列，限制了检测敏感性，因此，阳性结果还须核酸序列测定加以确认。HIV核酸定性检测阳性结果可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断的辅助指标，但不能单独用于HIV感染的确诊，成为限制PCR对于HIV感染诊断的临床应用。

3.3 定量检测

HIV核酸定量检测即病毒载量测定，感染HIV后病情发展速度直接与血浆中病毒载量呈正比。在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸，使窗口期缩短6～11.5d，且慢性潜伏期也能检出，便于早期辅助诊断；HIV病毒载量常用于用于评估疾病病程、监测抗病毒治疗成效、选择抗病毒治疗方案；还可用于鉴定出生后18个月内的婴儿血液中的HIV-IgG抗体是否来自于母体，婴儿是否感染HIV（母婴诊断）。当前，常用的定量检测方法有较高的敏感性、特异性和可重复性。