探讨分子生物学技术在微生物检验中的应用研究

[摘要] 伴随分子生物学的技术飞速发展，微生物的检验方法与技术被广泛应用与研究。近几年，国内外的学者不断深入研究，已经建立适用、快速、低耗、简便与特异微生物的检验方法与技术，特别是对于分子生物学的技术应用，其中较为突出的有生物芯片、聚合酶链的反应与核酸探针等。该文着重分析了各种分子生物学的技术应用进展。

[关键词] 分子生物学；微生物检验；应用

[中图分类号] R7 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）05（c）-0191-02

通常传统微生物的检验技术时根据微生物具体存在状态对其分裂与地位进行确定，这种传统检测方式容易存在误差，就算是同一类微生物，生理生化的性状与形态都会存在差异，鉴定准确性难以保证。而在微生物检验的工作中，研究现代化分子生物学的技术时，主要是研究蛋白质遗传、结构与功能；生物大分子；核算机器的表达产物等互相作用科学。将现代化分子的生物学技术应用于微生物的检验中时，能够获得以下效果，现代的分子生物学研究的领域比较广泛，在很大程度上可以提高检验范围与精度；伴随微生物检验认可的程度提高，可以促进分子生物学发展，进而推动各领域工作的进步。近几年，伴随微生物的检验认可程度不断提升，推动了现代化分子生物学发展与进步，这在某种程度上会促进社会进步，提高检验准确性与可靠性。

1 聚合酶链的反应技术

由于微生物检验种类比较多。如果检验目的不一样，容易造成检验技术方面的差异。在现代的分子生物学检验技术中，其要求的是高准确性、高精度与快速度，在各种检验技术中聚合酶链的反应技术属于一种分子生物学的技术，其较具有代表性。就目前而言，应用聚合酶链的反应技术可以同时鉴定与检测不同病原的微生物，检验原理如下：在同一聚合酶链的反应管之中，能够添加不同病原微生物特异性的引物，产生聚合酶链的反应，实现同时检测[1]。

2 基因芯片的技术

为了在微生物的检验中充分发挥现代化分子生物学的技术应用效果，相关人员逐渐研究出较高端基因芯片的技术。早在上个世纪的90年代就开发出了基因芯片的技术，其是把尼龙膜与玻片当作载体，于单位面积中有秩序、高密度排列中很多生物活性的分子，主要是为了能够一同对多种疾病进行检测，或是对不同生物的样品进行分析。在较为复杂微生物的检验中比较常用基因芯片的技术，在长期总结和发展过程中，基因芯片的技术以相对成熟，并且该技术有着其他方式无法比拟的优越性。①可以将抗体产生以前感染患者检测中应用基因芯片的技术，以便临床上诊断。目前，大部分患者的临床症状比较特殊，且不能经传统检测技术获取精确信息与数据，这使得治疗过程因为缺乏准确数据，也就不能针对患者实际情况治疗，导致患者最佳治疗时机延误，影响了患者康复。但采取基因芯片的技术进行检测，能够早诊断患者基本，做到早发现与早治疗。②基因芯片的技术能够弥补其他检测技术缺陷，例如：可疑检测出其他技术无法决定的疾病感染，在临床上，感染始终是个难题，应用基因芯片的技术，可以准确确定患者感染程度与范围等。

3 核算探针的技术

伴随现代化分子生物学的技术发展，在很大程度上完善了微生物的检验体系。因为卫生影响较为广泛，尤其对于生物、社会与医学领域有着决定性影响。因此，如果单纯应用基因芯片或是聚合酶链的反应技术来检测，难以取得理想效果，这就需要相关人员深入研究核算探针的技术[2]。核算探针的技术和上文两种技術有着本质区别，就概念而言，核算探针的技术主要指的是带有标记特异DNA的片段，按照碱基互补的原则，这种技术能够和目的DNA进行杂交，然后通过特定方式对标记物进行测定。从现今微生物的检验来看，核算探针的技术在下面几个方面应用比较广泛。①核算探针可以对细菌中抗药基因进行检测，而抗药基因检测的结果可以为医学治疗药物研究提供参考，防止患者治疗时体中出现抗药性，以充分发挥药物治疗的效果，缓解患者病情。②核算探针技术能够检测那些用于生化鉴定、不能培养、缺少诊断抗原以及不能观察微生物的产物，在临床上，肠毒素的检测主要使用核算探针检测，这种检测技术可以有效获取肠毒素指标与相关数据，进而给临床治疗的工作提供参考。③核算探针能够对病毒病进行检测，如：在流行病学的调查与感染病毒检测中均会使用核算探针，并且能够用来对无毒菌株以及有毒菌株进行区分。核算探针这项技术能够直接检测物质本质，并且经物质表面获取结果，尤其在DNA的检测方面有着极高的权威性与准确率。

4 DNA分子的标记技术

在很多微生物的分类、检验与遗传育种方面都会使用DNA分子的标记技术，就目前而言，DNA分子的标记技术主要包含3种：①把分子杂交与电泳作为核心；②把PCR与电泳作为核心；③把DNA的序列作为核心。

4.1 随机扩增的多态性DNA/RAPD

RAPD的技术主要是通过随机合成引物，应用PCR来扩增靶细胞的DNA，因为引物的长度不一致，容易产生各种大小不一样PCR扩增的产物。现阶段，RAPD应用比较广泛，主要操作过程如下：提取样本中的DNA，随机对引物PCR进行扩增，对电泳进行凝胶，放射自显影或是EB染色。通常情况下，在分析与鉴定菌株之间、微生物中间以及亚种间亲缘关系时，经常会采用RAPD的技术，即使在微生物的检验中，RAPD的技术比较简便与快速[3]。

4.2 限制片段的长度多态性DNA/RFLP

在体中不同生物结构存在巨大差异，同类生物不同个体间，就算蛋白质的产物功能与结构基本一样或是完全一样，但是DNA的水平还是存在明显差异。而RFLP指纹图谱在微生物种类与种间分型鉴定中比较适用，属于种群、种与种类分类手段。通常RFLP的技术操作过程如下：提取样本中的DNA，限制内切酶的酶切，对电泳进行凝胶，杂交，清洗膜，最后放射自显影。

5 分析核酸序列

分析核酸序列主要过程是在核算的序列中查找基因位置，并对已知DNA的序列进行标记。核算的测序步骤如下：提取与纯化核酸，进行PCR的扩增，应用自动序列的分析仪测序PCR产物，把序列提交至GeNBANk，经BLAST的程序以及已知序列分析相似性，分析系统发育情况，然后绘制出系统的发育树。在处理数据时，微生物种、属间遗传距离计算方式比较多，Jukes-CNAtor的方法比较常用。在完成遗传距离的计算以后，要建立系统的进化树，同样有很多建立方法，例如：NeighborJoiN。分析系统的发育树时，常用软件包含ARB与MEGA等。在真菌核酸的序列中，测序对象主要是18SrDNA，主要原因是长度相对较长，所含信息比较多。一般情况下，ITS的序列属于中度保守的序列，保守性的表现在种内较为一致，但是在种间则有显著差异。也就因为ITS的序列该特点，使其比较适用于分析种类或是属内物种间差异明显的一些菌群。对于细菌而言，16SrRNA的序列分析逐渐变成种属分类与鉴定常用的方式，现已报道了超过2500个16SrRNA的序列。在微生物的细胞之中16SrRNA数量比较大，其分子量相对适中，提取比较容易，并且16SrRNA 一级结构较为保守，其在微生物分类与检验中比较有用，能够方便微生物间同源性的关系分析。通常认为只要16SrRNA的序列同源性超过97%，就是同一个种类，但是16SrRNA的寡核苷酸中顺序分析无法对微生物的菌株进行鉴定，例如：脓肿的分枝杆菌与龟分支的杆菌中，DNA的同源性<50%，但是16SrRNA的基因同源性高达99%[4]。

6 PCR的技术

在微生物的检验中，PCR的技术比较常见，其是在同一个反应管之中，添加不同病原微生物特异性的引物实施扩增，能够用在各种病原性微生物同时鉴定与检测中。早在上个世纪的90年代中期，我国就开始广泛应用PCR的技术对感染病原性微生物进行检测，例如：性病的致病菌、人类免疫的缺陷病毒以及肝炎病毒等。目前，PCR的技术逐渐用在结核杆菌的耐药基因与分枝杆菌检测与鉴定中，并且禽流感致病毒检测中，同样采取了PCR的技术。PCR的技术主要优势是准确、快速与灵敏，但凡样本中存在病原体，应用PCR就能够检测出。并且PCR的技术不会因为混合标本而受到影响，能够从很多正常菌群标本之中检测出病原菌，其对不易分离的病原菌鉴定比较有用，例如：螺旋体、分枝杆菌以及支原体衣原体等，可见在病原性微生物检验中，PCR应用的前景比较好。但是传统PCR的技术也有诸多问题，例如：PCR在检测RNA的病毒时，操作比较繁琐，并且种间的污染环节比较多，容易出现假阴性或是假阳性的结果；产生引物的二聚体。因此，为有效规避传统PCR的技术缺陷，逐渐研发出新型PCR的技术，并且已经用在实践中，如：引物DNA的扩增、热启动的PCR、多重PCR以及逆转录的PCR等[5]。

7 結语

综上，在微生物的检验中，现代化分子生物学的技术应用越来越普遍，这种技术优势比较明显，并且较为先进，能够为临床治疗提供有效的依据。在微生物的检验中，分子生物学主要优势就是广泛、快速、高效与准确，近几年，分子生物学的技术逐渐向着特异性与自动化方向进步，同时和其他技术、学科进行融合，这将会拓展分子生物学应用范围，促进其发展与推广。

[参考文献]

[1] 梅冰，陆翔，王永乔.微生物非培养技术在环境微生物领域的研究进展[J].化学工程师，2015，29（10）：31-33.

[2] 黄东红，郑友限，潘少敏.泉州市6例布鲁菌病的微生物生化鉴定及分子生物学确认[J].福建医科大学学报，2014，48（2）：125-127.

[3] 杨燕，孙梦家，蒋波.药品无菌检查中污染微生物的鉴定与OOS调查分析[J].中国医药工业杂志，2016，47（12）：1559-1563.

[4] 方婷子，施春雷.分子技术在食源性致病微生物检测中的应用[J].食品安全质量检测学报，2014，23（7）：1923-1929.

[5] 陈雯雯，段文峰，刘洋，等.新技术在食品微生物检验检测中的应用[J].上海师范大学学报：自然科学版，2016，45（1）：121-126.

（收稿日期：2017-02-22）